sábado, 26 de noviembre de 2011

GLOSARIO

Aislamiento: Consiste en separar los microorganismos de interés de una comunidad microbiana.

Bacteria gram positiva: Son aquellas que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram. característica ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias.
La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano.

 Bioinsecticidas: son productos cuya finalidad principal es eliminar los insectos, con ayuda de sistemas biológicos.

Cepa: es, en microbiología, una variante fenotípica de una especie o, incluso, de un taxón inferior, usualmente propagada clonalmente, debido al interés en la conservación de sus cualidades definitorias.

Crecimiento vegetativo: Donde las bacterias se duplican en intervalos de 30 a 40 mintuos.

Duplicación por bipartición: este es un tipo de reproducción asexual en que las células divide dando origen a 2 células genéticamente idénticas entre si pero de menor tamaño que la inicial.

Esporulación: Es tanto un tipo de reproducción mediante esporas o endosporas, como el término utilizado para designar la formación (esporogénesis) y liberación de esporas.

Exosporio:  La espora posee una cubierta fina conocida como exosporio, que cubre la capa de espora.

Fermentar:  Proceso catabólico de oxidación incompleta, totalmente anaeróbico, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.

Lisis: La lisis celular es la rotura de la membrana celular.

Placas de agar:  es una placa de Petri que contiene un medio de cultivo.

Tinción: Es una técnica auxiliar en microscopía para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio.

Transgénico: son aquellos que fueron producidos a partir de un organismo modificado genéticamente mediante ingeniería genética.

Ubicua: un organismo ubicuo es aquel que ocupa todas la áreas geográficas del globo.

REFERENCIAS

sábado, 19 de noviembre de 2011

ALGORITMO PARA EL AISLAMIENTO DE BACILLUS THURINGIENSIS.

A continuación les presentamos un algoritmo que pueden utilizar para aislar este microorganismo:
 

Imagen 10. Algoritmo para aislar al Bt.
 

viernes, 18 de noviembre de 2011

AISLAMIENTO DE Bt.

Para el aisalamiento de el Bacillus thuringiensis, el muestreo se realizará en los campos agrícolas de Calera de V.R., Zacatecas. Es común encontrar este tipo de microoorganismos en los plantios de maíz, por lo que nos dirigiremos a estos suelos cultivados para el muestreo de suelo.
De las zonas cultivadas se tomarán 3  muestras de  50g en tres lugares diferentes del cultivo.  Se homogeneizarán y se tomará 1 g de cada una, el cual  se mezclará con 10 mL de agua destilada estéril en un tubo de ensayo, y se someterá  a agitación vigorosa. Los  tubos se incubarán  en un baño  María a 70°C durante 30 min,  con el objetivo de seleccionar las esporas presentes en la mezcla.

 Luego se dejaran en hielo por igual tiempo, se agitaran vigorosamente y se  dejaran reposar, se observará  la distinción de esporas como muestra la imagen 8  y se procederá a realizar diluciones decimales en solución salina 0.85% hasta 10-3 a concentración sencilla. (Seguir metodología anexa).


Imagen 8. Distinción de Bt.


Posteriormente se colocarán , 0.1 mL de las diluciones,  se depositarán en placas con agar nutritivo,  y se esparcerán con varilla acodada , dejando incubar a 28°C de  48-72 h hasta visualizar colonias individuales. Se examinarán las colonias crecidas y se seleccionarán por su aspecto y morfología mediante observación al microscopio estereoscópico. Las colonias de B. thuringiensis, se distinguen por cumplir las siguiente morfología:

o    Contorno irregular
o    Color blanco con cierta tonalidad grisácea
o    Textura lisa y cerosa en el centro
o    Mate en los bordes.


 Se determinará la forma bacilar, distensión del esporangio, localización y morfología de la espora mediante observación de la tinción de Wirtz al microscopio óptico 1000 X, características descritas para el grupo cereus del género Bacillus thuringiensis, como muestra la imagen 9.

Imagen 9. Esporas de Bt.

Se tomarán  asadas y harán suspenciones  en solución salina 0.85% hasta ajustar con el tubo 3 del Nefelometro de Mcfarland, se tomará una alícuota de 0.1mL  y  se sembrará  por extención en placa en una caja Petri con agar nutritivo, se nbubara  a 28°C por 72 horas, después del tiempo de incubación, se observará si las colonias crecidas presentan las  caracteristicas del microorganismo(mencionadas anteriormente), se tomarán 5  asadas de las colonias y se harán 3 suspenciones de las  esporas y cristales aislados en glicerol al 50%,  las cuales  se conservarán a -20°C hasta el momento de uso.

MATERIALES Y REACTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE LAS ESPORAS Y LOS CRISTALES DEL BACILLUS THURINGIENSIS

  • Material:
    Balanza
    Cuchara pala
    2Vaso pp de 100mL
    Agua destilada
    Matraz aforado de 100mL
    9 tubos de ensayo
    Pipeta de 10mL
    11 Pipeta de 1mL
    Tapones de algodón
    Autoclave 121°C
    Horno 170°C
    Papel Kraft
    Portaobjetos
            Pinzas
            Mechero Bunsen
    Microscopio
     Aceite de inmersión
    Varilla acodada
    Cerillos
    10 cajas petri
    3 asa
    Torundas de algodón
    Gasas
    Pipeta pasteur
    Nefelometro De McFarland
    4 pesa sustancias
    Reactivos:
  • Glicerol al 50%
  • Piseta de agua destilada
  • Etanol
    0.85g de NaCl
    23g de agar nutritivo
          - Colorantes:
            Solución de verde malaquita (5%)
            Solución de safranina (0,5%)
    NOTA:Realizar todos los procedimientos y técnicas de aislamiento en condiciones de esterilidad.
    Esterilizar  el material previamente al aislamiento a calor húmedo 121°C, 15lb de presión por 15min.
    Para realizar diluciones decimales:
    o   Preparación de solución salina al 0.85%estéril:
    1.       Pesar 0.85g de NaCl
    2.      Diluir con agua destilada en vaso de pp de 100mL
    3.      Colocar en matraz para aforado de 100mL y aforar
    4.      Vaciar en vaso de pp de 100mL y trasferir 9mL a 9 tubos de ensayo.
    5.      Cubrir tubos con tapones de algodó
    6.      Esterilizar  en autoclave (121°C, 15lb de presión por 15min)
    o   Preparación de diluciones decimales, respecto a la NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras para análisis microbiológico . (Bajo condiciones de esterilidad).
    1.        Transferir con pipeta 1mL de la dilución primaria (tubo de ensayo), en otro tubo con 9mL de             solució salina (dilución 10-1)
    2.      Homogeinizar tubo.
    3.      Transferirir 1mL  este tubo a otro con solución salina y homogeinizar (dilución 10-2)
    4.      Utilizar una pipeta diferente y estéril en cada dilución.
    5.     Transferir 1mL de la dulución 10-2 a un tubo con los 9mL de solución salina y homogeinizar (dilución 10-3).
    Tinción de esporas (wirtz-conklin)
    Fundamento:
    Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.
    La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:
    1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.
    2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.
    Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.
    o   Realización del Frotis:
    1.       Colocar una gota de agua destilada en portaobjetos
    2.      Tomar una asada del cultivo y colocar sobre la gota.
    3.      Secar al aire
    4.      Fijar con tres pasadas en el mechero
    o   Realización de la tinción
    1.       Preparar los frotis bacterianos indicados.
    2.      Teñir con verde malaquita.
    3.      Con unas pinzas de colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.
    4.      Nota: evitar que la muestra hierva.
    5.      Añadir más colorante si éste se evapora.
    6.      Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
    7.      Teñir con safranina 1 min.
    8.       Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
    9.      Secar la preparación.
    10.   Observar la preparación al microscopio
    Tecnica de Extensión en placa
    Fundamento: Está técnica permite que las bacterias que se obtienen puedan ser estudiadas en cuanto a morfología colonial, crecimiento y actividad metabolica de la bacteria estudiada.
    1.       Colocar el volumen deseado en el centro de la caja Petri
    2.      Sumergir la varilla acodada en etanol 
    3.      Flamear en el mechero de bunsen, dejar enfriar la varilla
    4.      Colocar varilla sobre el volumen de alícuota
    5.      Extender dicho volumen con un solo movimiento de forma circular.
    o   Preparación del medio Agar nutritivo(medio selectivo respecto a la NOM-065)
    El Agar Nutritivo es un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no exigentes. En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono.
  • El agar es adicionado como agente solidificante y es lo que lo diferencia del caldo nutritivo.

Formula:
o   Peptona de Gelatina 5.0
o   Extracto de Carne 3.0
o   Agar Bacteriológico 15.0
o   pH 6.8 ± 0.2


Método:
  • 1.       Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada.
    2.      Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.
    3.      Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos.
    4.      Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C
    5.      Vaciar en placas de Petri estériles.