AISLAMIENTO DE Bt.

Para el aisalamiento de el Bacillus thuringiensis, el muestreo se realizará en los campos agrícolas de Calera de V.R., Zacatecas. Es común encontrar este tipo de microoorganismos en los plantios de maíz, por lo que nos dirigiremos a estos suelos cultivados para el muestreo de suelo.

De las zonas cultivadas se tomarán 3  muestras de  50g en tres lugares diferentes del cultivo.  Se homogeneizarán y se tomará 1 g de cada una, el cual  se mezclará con 10 mL de agua destilada estéril en un tubo de ensayo, y se someterá  a agitación vigorosa. Los  tubos se incubarán  en un baño  María a 70°C durante 30 min,  con el objetivo de seleccionar las esporas presentes en la mezcla.

 Luego se dejaran en hielo por igual tiempo, se agitaran vigorosamente y se  dejaran reposar, se observará  la distinción de esporas como muestra la imagen 8  y se procederá a realizar diluciones decimales en solución salina 0.85% hasta 10^-3 a concentración sencilla. (Seguir metodología anexa).



Imagen 8. Distinción de Bt.



Posteriormente se colocarán , 0.1 mL de las diluciones,  se depositarán en placas con agar nutritivo,  y se esparcerán con varilla acodada , dejando incubar a 28°C de  48-72 h hasta visualizar colonias individuales. Se examinarán las colonias crecidas y se seleccionarán por su aspecto y morfología mediante observación al microscopio estereoscópico. Las colonias de B. thuringiensis, se distinguen por cumplir las siguiente morfología:

o    Contorno irregular

o    Color blanco con cierta tonalidad grisácea

o    Textura lisa y cerosa en el centro

o    Mate en los bordes.

 Se determinará la forma bacilar, distensión del esporangio, localización y morfología de la espora mediante observación de la tinción de Wirtz al microscopio óptico 1000 X, características descritas para el grupo cereus del género Bacillus thuringiensis, como muestra la imagen 9.



Imagen 9. Esporas de Bt.


Se tomarán  asadas y harán suspenciones  en solución salina 0.85% hasta ajustar con el tubo 3 del Nefelometro de Mcfarland, se tomará una alícuota de 0.1mL  y  se sembrará  por extención en placa en una caja Petri con agar nutritivo, se nbubara  a 28°C por 72 horas, después del tiempo de incubación, se observará si las colonias crecidas presentan las  caracteristicas del microorganismo(mencionadas anteriormente), se tomarán 5  asadas de las colonias y se harán 3 suspenciones de las  esporas y cristales aislados en glicerol al 50%,  las cuales  se conservarán a -20°C hasta el momento de uso.