MATERIALES Y REACTIVOS PARA EL AISLAMIENTO DE LAS ESPORAS Y LOS CRISTALES DEL BACILLUS THURINGIENSIS

• Material:

  Balanza

  Cuchara pala

  2Vaso pp de 100mL

  Agua destilada

  Matraz aforado de 100mL

  9 tubos de ensayo

  Pipeta de 10mL

  11 Pipeta de 1mL

  Tapones de algodón

  Autoclave 121°C

  Horno 170°C

  Papel Kraft

  Portaobjetos

          Pinzas

          Mechero Bunsen

  Microscopio

   Aceite de inmersión

  Varilla acodada

  Cerillos

  10 cajas petri

  3 asa

  Torundas de algodón

  Gasas

  Pipeta pasteur

  Nefelometro De McFarland

  4 pesa sustancias

  Reactivos:
• Glicerol al 50%
• Piseta de agua destilada
• Etanol

  0.85g de NaCl

  23g de agar nutritivo

        - Colorantes:

          Solución de verde malaquita (5%)

          Solución de safranina (0,5%)

  NOTA:Realizar todos los procedimientos y técnicas de aislamiento en condiciones de esterilidad.

  Esterilizar  el material previamente al aislamiento a calor húmedo 121°C, 15lb de presión por 15min.

  Para realizar diluciones decimales:

  o   Preparación de solución salina al 0.85%estéril:

  1.       Pesar 0.85g de NaCl

  2.      Diluir con agua destilada en vaso de pp de 100mL

  3.      Colocar en matraz para aforado de 100mL y aforar

  4.      Vaciar en vaso de pp de 100mL y trasferir 9mL a 9 tubos de ensayo.

  5.      Cubrir tubos con tapones de algodó

  6.      Esterilizar  en autoclave (121°C, 15lb de presión por 15min)

  o   Preparación de diluciones decimales, respecto a la NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparación y dilución de muestras para análisis microbiológico . (Bajo condiciones de esterilidad).

  1.        Transferir con pipeta 1mL de la dilución primaria (tubo de ensayo), en otro tubo con 9mL de             solució salina (dilución 10^-1)

  2.      Homogeinizar tubo.

  3.      Transferirir 1mL  este tubo a otro con solución salina y homogeinizar (dilución 10^-2)

  4.      Utilizar una pipeta diferente y estéril en cada dilución.

  5.     Transferir 1mL de la dulución 10^-2 a un tubo con los 9mL de solución salina y homogeinizar (dilución 10^-3).

  Tinción de esporas (wirtz-conklin)

  Fundamento:

  Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción.

  La tinción específica de esporas requiere dos colorantes:

  1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente.

  2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas.

  Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante.

  o   Realización del Frotis:

  1.       Colocar una gota de agua destilada en portaobjetos

  2.      Tomar una asada del cultivo y colocar sobre la gota.

  3.      Secar al aire

  4.      Fijar con tres pasadas en el mechero

  o   Realización de la tinción

  1.       Preparar los frotis bacterianos indicados.

  2.      Teñir con verde malaquita.

  3.      Con unas pinzas de colocar la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5 min.

  4.      Nota: evitar que la muestra hierva.

  5.      Añadir más colorante si éste se evapora.

  6.      Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

  7.      Teñir con safranina 1 min.

  8.       Lavar con abundante agua el exceso de colorante.

  9.      Secar la preparación.

  10.   Observar la preparación al microscopio

  Tecnica de Extensión en placa

  Fundamento: Está técnica permite que las bacterias que se obtienen puedan ser estudiadas en cuanto a morfología colonial, crecimiento y actividad metabolica de la bacteria estudiada.

  1.       Colocar el volumen deseado en el centro de la caja Petri

  2.      Sumergir la varilla acodada en etanol 

  3.      Flamear en el mechero de bunsen, dejar enfriar la varilla

  4.      Colocar varilla sobre el volumen de alícuota

  5.      Extender dicho volumen con un solo movimiento de forma circular.

  o   Preparación del medio Agar nutritivo(medio selectivo respecto a la NOM-065)

  El Agar Nutritivo es un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no exigentes. En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono.
• El agar es adicionado como agente solidificante y es lo que lo diferencia del caldo nutritivo.

Formula:

o   Peptona de Gelatina 5.0

o   Extracto de Carne 3.0

o   Agar Bacteriológico 15.0

o   pH 6.8 ± 0.2

Método:

• 1.       Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada.

  2.      Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto.

  3.      Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos.

  4.      Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C

  5.      Vaciar en placas de Petri estériles.
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